一.細胞復(fù)蘇與培養(yǎng)
　　
　　將液氮或-80℃保存的腫瘤細胞于37℃水浴，快速溶化，用8.0ml培養(yǎng)基混勻已融化的腫瘤細胞懸液，于1500轉(zhuǎn)/分，離心3分鐘。棄上清，再吸取8.0ml培養(yǎng)基質(zhì)混勻細胞沉淀，再1500轉(zhuǎn)/分，離心3分鐘，棄上清，細胞沉淀用1.0ml培養(yǎng)基混勻，備用。另取一個75cm2方瓶，加入14.0ml培養(yǎng)基質(zhì)，將上述制備的含腫瘤細胞懸液(1.0ml)加入此方瓶中，于37℃，5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。
　　
　　若此腫瘤細胞懸浮生長，大約3－4天細胞基質(zhì)會變黃，5.0ml細胞懸液可傳代一個方瓶培養(yǎng)，可用3－4個方瓶培養(yǎng)，一個方瓶中呈對數(shù)生長的腫瘤細胞可達1-1.5×107個，根據(jù)試驗所需，可決定傳代的次數(shù)。若此腫瘤細胞呈貼壁生長，經(jīng)過3-4天，腫瘤細胞生長至80%-95%單層時，棄上清，用0.5mM的EDTA(難消化的腫瘤細胞用0.25%胰酶1.0ml)，處理腫瘤細胞大約3-5分鐘，用倒置顯微鏡觀察，當(dāng)90%的腫瘤細胞變圓時，即可用彎管吹打并將消化的細胞轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，于1500轉(zhuǎn)/分下，離心3分鐘，棄上清，加少許培養(yǎng)基混勻，可傳代3個75cm2方瓶擴大培養(yǎng)。
　　
　　二.細胞凍存
　　
　　將對數(shù)生長的腫瘤細胞用1個75cm2方瓶按上述方法收集，于1500轉(zhuǎn)/分離心3分鐘，棄上清，用保種液(含10%DMSO的小牛血清)3.0ml混勻，分別加入到2-3只保種管中，寫上腫瘤細胞名稱、時間、保種者姓名，放-80℃保存，次日將它們轉(zhuǎn)移到液氮中保存(注：-80℃下可保存細胞半年至一年，液氮可保存細胞5-10年，甚至更長的時間)。以上所有物品均需經(jīng)過高溫滅菌(121℃，30分鐘)，培養(yǎng)基質(zhì)則經(jīng)過過濾(0.22uM)除菌，所有操作均必須遵守?zé)o菌操作技術(shù)，避免細菌、真菌、病原體、衣原體等污染。