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流式細(xì)胞技術(shù)實(shí)驗(yàn)方法
更新時(shí)間:2017-05-02 點(diǎn)擊次數(shù):3265次

流式細(xì)胞技術(shù)實(shí)驗(yàn)方法

PI 染色操作步驟

1、將單細(xì)胞懸液加入2ml圓底離心管中,離心,1500rpm , 5min,棄上清液。

2、加入PBS 1ml離心洗滌1次,棄上清。

3、加入2ml預(yù)冷的70%酒精,4℃固定30min,或是-20℃固定過夜。

4、離心,棄上清液。

5、用1×PBS 1ml洗滌1次,離心。

6、加入RNase A (工作濃度20ug/ml)于500ul 1×PBS中,37℃孵育30min,離心。

7、用1×PBS 1ml洗滌1次,離心。

8、加入PI(工作濃度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中,室溫避光孵育30min。

9、混勻,過300目篩網(wǎng),置流式管中, 4℃冰箱保存,待測(cè)。

GFP PI染色操作步驟

1、將單細(xì)胞懸液加入2ml圓底離心管中,離心,1500rpm , 5min,棄上清液。

2、加入PBS 1ml離心洗滌1次,棄上清。

3、加入2ml預(yù)冷PFA,PFA的濃度根據(jù)細(xì)胞的特點(diǎn)進(jìn)行調(diào)節(jié),4℃固定30min。 以下步驟同PI 染色操作步驟的(4-9)

細(xì)胞表面直接免疫熒光染色操作步驟

1、將單細(xì)胞懸液加入2ml圓底離心管中,離心,1500rpm , 5min,棄上清液。

2、以冷PBA 1ml,離心洗滌,棄上清液。

3、加入用PBA稀釋的熒光素標(biāo)記的抗體200ul。用微量移液器輕輕吹打混勻,4℃或置冰上孵育30min-1h。

4、離心棄上清液。

5、加入冷PBS1ml,離心洗滌2次,以除去未結(jié)合的多余抗體成分。

6、向細(xì)胞中加入冷PBS 500ul,吹打混勻,置流式管中,4℃避光保存,待測(cè)。

細(xì)胞表面間接免疫熒光染色操作步驟

1-2、同細(xì)胞表面直接免疫熒光染色操作步驟

3、 用PBA稀釋的*抗體200ul,對(duì)照管加入對(duì)應(yīng)于一抗的正常實(shí)驗(yàn)動(dòng)物IgG,輕輕吹打混勻,4℃或置冰上孵育1、5-2h。離心,棄上清。

4、 PBS 1ml離心洗滌1次,以去除多余的未結(jié)合的特異性抗體。

5、 PBA適當(dāng)稀釋的熒光素標(biāo)記的第二抗體200ul。吹打混勻,4℃或置冰上孵育30min,避光。

6、 PBS 1ml離心洗滌2次。

7、將細(xì)胞重新懸浮于500ulPBS中,混勻,置流式管中,避光,4℃冰箱保存,待測(cè)。


胞內(nèi)直接免疫熒光染色操作步驟

1、將單細(xì)胞懸液加入2ml圓底離心管中,離心,1500 rpm , 5 min,棄上清液。

2、用1×PBS 1 ml洗滌1次,離心。

3、4% PFA 1ml,4 ℃固定30min。

4、用1×PBS 1ml洗滌1次,離心。

5、0.1% Triton-100 1ml, 室溫10min。

6、用1×PBS 1ml洗滌1次,離心。

7、加入用PBA稀釋的熒光素標(biāo)記的抗體200ul,用微量移液器輕輕吹打混勻,4℃或置冰上孵育30 min-1h。

8、離心棄上清液。

9、加入冷PBS1ml,離心洗滌2次,以除去未結(jié)合的多余抗體成分。

10、向細(xì)胞中加入冷PBS 500ul,吹打混勻,置流式管中,4℃避光保存,待測(cè)。

胞內(nèi)間接免疫熒光染色操作步驟

1-6、同胞內(nèi)直接免疫熒光染色操作步驟

7、加入用PBA稀釋的*抗體200 ul,對(duì)照管加入對(duì)應(yīng)于一抗的正常實(shí)驗(yàn)動(dòng)物IgG,輕輕吹打混勻,4 ℃或置冰上孵育1.5-2 h。離心,棄上清。

8、冷PBS 1ml離心洗滌1次,以去除多余的未結(jié)合的特異性抗體。

9、加入PBA適當(dāng)稀釋的熒光素標(biāo)記的第二抗體200 ul。吹打混勻,4 ℃或置冰上孵育30 min,避光。

10、冷PBA 1ml離心洗滌2次。

11、將細(xì)胞重新懸浮于500 ul PBS中,混勻,置流式管中,避光,4 ℃冰箱保存,待測(cè)。
備注:

1、 RNase A: 貯液濃度:1mg/ml ;

工作液配制:加1 mg/ml貯液 10ul于500ul 1×PBS中,使終濃度為 20ug/ml。

2、PI: 貯液濃度:2.5mg/ml;

工作液配制: 加2、5 mg/ml貯液 10ul于500ul 1×PBS中,使終濃度為 50ug/ml。

3、PBA : 即PBS加1-2% 牛血清白蛋白,加0.1%疊氮鈉。

4、檢測(cè)樣品細(xì)胞濃度1x10 /ml。

 

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